In vitro Differenzierung humaner iPS-Zellen und Generierung einer DISC1-Knockout-Zelllinie mithilfe des CRISPR-Cas9-Systems

In vitro Differenzierung humaner iPS-Zellen und Generierung einer DISC1-Knockout-Zelllinie mithilfe des CRISPR-Cas9-Systems
Haag K
Master-Thesis, Studiengang Biomedical Sciences, Fakultät Life Sciences, Hochschule Albstadt-Sigmaringen. 2016. 70 Seiten.

Induzierten pluripotenten Stammzellen wird seit ihrer Entdeckung im Jahr 2006 ein großes Potential von der regenerativen Medizin bis hin zur Krankheitsursachenforschung zugesprochen. Insbesondere iPSC-Testmodelle gelten derzeit als die Hoffnungsträger für Arzneistoffforschungen in vitro. In dieser Arbeit werden die mit Yamankas Methode reprogrammierten iPSC-Zelllinien aus drei Spendergruppen mittels endodermale und mesodermale in vitro Differenzierung charakterisiert und so ihre Pluripotenz nachgewiesen. Die iPS-Zellen stammen dabei von Patienten mit Schizophrenie oder Autismus sowie von gesunden Individuen. Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt jedoch viel mehr auf der Etablierung der CRISPR/Cas9-Methode an einer iPS-Zelllinie eines gesunden Spenders. Dabei wird die genaue Vorgehensweise des Knockouts eines mit Schizophrenieassoziierten Risikogens - dem DISC1-Gen – beschrieben. Langfristig sollen dadurch Auswirkungen des DISC1-Knockouts und die Relevanz in der Schizophrenie untersucht werden. Im Nachfolgenden wird über ein duales gRNA-Plasmid-System nahezu das ganze Exon 2 des DISC1-Gens ausgeschnitten und anschließend über eine genomische PCR analysiert. Dieser Prozess wird zunächst in HEK 293FT-Zellen zur Überprüfung der gRNA-Funktionen etabliert und dann in den humanen iPSCs angewandt.