Das Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Cas9 System ist eine enzymbasierte Technik zur Genom Editierung. Das Nuklease-Enzym Cas9 ist in der Lage, an zielspezifischen Sequenzen in der genomischen DNA (gDNA) einen Doppelstrangbruch (DSB) zu induzieren. Der Nukleasekomplex wird über eine guide-RNA (gRNA) zur Zielsequenz geführt. Auf Grund solcher präziser Zielführung ist das CRISPR/Cas9 System eine hocheffiziente Methode der Genommodifikation. Die Nickase (Cas9N) ist eine Mutante der Cas9 und kann auf Grund einer Punktmutation Einzelstrangbrüche (ESB, Nicks) anstelle von DSB induzieren.
Für die vorliegende Arbeit wurden mit Hilfe des CRISPR/Cas-Systems humane Pankreaskarzinomzelllinien erzeugt, welche das Protein Cas9N stabil exprimieren. Hierzu wurden die Zelllinien mit zwei Plasmiden transfiziert. Eines der Plasmide kodierte für die Sequenz einer zielgenspezifischen gRNA gegen den AAVS1 Lokus, sowie für das Cas9 Enzym. Das andere Plamsid beinhaltete die Sequenzen für zwei Homologie-Arme, welche zum einen die Cas9 induzierte Schnittstelle auf dem AAVS1 Lokus flankierten, als auch die zu integrierende Sequenz der Cas9N und einer Puromycinresistenzkassette. Der Nachweis der korrekten Insertion des Puromycin-Cas9N Konstrukts erfolgte zum einen über eine genomische PCR und zum andren wurde die Protein Expression von Cas9N per Western Blot validiert. Die aus den Pankreaskazinomzelllinien Panc.-1 und PaTu-8902 generierten mononklonalen Zelllinien wurden für zielgenspezifische Knockouts weiter verwendet. Vor der Etablierung der Zielgen Knockouts wurden die gRNA-Expressionsvektoren für die entprechenden Zielgene mit Hilfe des Gibson Assembly kloniert. Jeweils zwei gRNAs bildeten dabei ein gRNA-Paar, welche die Zielsequenz ca. 10 bp voneinander entfernt adressierten um einen Doppelstrangbruch zu generieren. Für jedes Zielgen wurden zwei gRNA-Paare designt, die jeweils ein anderes Exon des Zielgenes adressierten. Diese beiden gRNA-Paare wurden gemeinsam in die Zielzellen transfiziert. Hierdurch sollte eine entsprechend große Deletion in der genomischen Zielgenseqeunz induziert werden, die verlässlich zu einem Knockout des Zielgens führte. Die adressierten Zielgene waren IDO1, ADAM8, PTPN11, MSLN und BCL9L.
Die Validierung der Knockouts erfolgte über eine zielgenspezifische genomische PCR, sowie über den T7 Endonuklease Assay. Für die Zielgene IDO1 und BCL9L konnten in allen generierten monoklonalen Zelllinien das gewünschte Cas9N Event detektiert werden. Außerdem konnte in einer weiteren monoklonalen Zelllinie ein Cas9N Event für PTPN11 beobachtet werden.